普通光学显微镜以可见光为光源，利用玻璃透镜的折射原理实现放大成像。光线由下方光源出发，经过聚光器汇聚到标本上，透过标本的光被物镜进行第一次放大，形成倒置实像；该实像再经目镜进行第二次放大，观察者最终看到放大的虚像。依据阿贝衍射理论，最高分辨率受制于光波长，约为0.2μm（200nm），是光学显微镜的衍射极限。

由三大系统构成：①照明系统——光源（卤素灯/LED）+ 聚光器（Condenser）；②光学放大系统——物镜（Objective）+ 目镜（Eyepiece），两者均由多片镜片组组成以消球差和色差；③机械支撑系统——镜臂、镜台、粗/细调焦旋钮、物镜转换器。

由荷兰物理学家 F. Zernike 于1932年发明，并因此荣获1953年诺贝尔物理学奖。核心原理是将透过标本的可见光的相位差（光程差）转化为振幅差（明暗差），从而提高对比度。光线透过标本后发生折射，偏离原光路并被延迟 1/4λ；经过相板再增加或减少 1/4λ，总相位差达 1/2λ，两束光合轴后产生干涉，振幅增大或减小，形成可被肉眼分辨的对比度。

在普通显微镜基础上增加了两个关键部件：①环状光阑转盘聚光器（Annular Diaphragm Condenser）——产生空心圆锥形照明光；②相板（Phase Plate）——内嵌于相差物镜后焦面，包含相位延迟区和吸光区；此外还配合调中望远镜进行合轴调整。

将普通自然光通过起偏镜（Polarizer）转化为线性偏振光，照射具有双折射性的样品。各向异性材料（如晶体）会将偏振光分为振动方向不同的两束光（o光与e光），两束光通过检偏镜（Analyzer）后相互干涉，产生干涉色彩。正交偏光下（起偏镜与检偏镜互相垂直），各向同性物质视野呈黑暗，各向异性物质呈现明亮的干涉色，据此可鉴别物质的光学性质。

a. 光源——宜用单色光（同波长光干涉效果更一致）；b. 起偏镜——将自然光变为线偏振光；c. 旋转载物台——可360°旋转以测量消光角；d. 补偿器/相位片——精确测定光程差；e. 检偏镜——与起偏镜正交放置；f. 伯特兰透镜——将物镜后焦面的干涉图放大供目镜观察；g. 无应力物镜——避免玻璃内应力引入虚假双折射。

倒置显微镜的结构与普通显微镜相同，但光源位于载物台上方，物镜位于载物台下方，整体光路上下颠倒，故称"倒置"。这种布局使得培养瓶/培养皿可以直接置于载物台上，物镜从下方透过瓶底观察，特别适合观察悬浮于培养液中的活细胞，无需取出细胞或制作切片。

长工作距离聚光器——安装在载物台上方，上方带有滤光片和孔径光阑；长工作距离物镜——工作距离通常超过普通物镜以适应培养瓶底厚度；记录装置——配备摄影镜筒，支持缩时电影（Time-lapse）记录生命活动过程。

基于丁达尔效应（Tyndall Effect）设计。暗视野聚光器中央装有遮光板，使照明光线不能直接进入物镜，而以极大倾斜角（中空圆锥光）照射标本。标本遇光发生反射与衍射/散射，散射光进入物镜成像。结果是：视野背景全黑，被检物体以亮色轮廓显现于黑暗背景中。分辨率可比普通显微镜高约50倍，能检测到4–200nm的微粒，最小分辨可达 0.004μm，远超普通显微镜的 0.2μm 极限，但不能分辨物体内部细微结构。

荧光显微镜利用特定波长的光（激发光）照射标记有荧光染料的样品，激发荧光分子从基态跃迁到激发态，在返回基态时发出波长更长（能量更低）的荧光（斯托克斯位移）。落射式荧光系统——激发光从物镜上方经二向色镜（Dichroic Mirror）反射后通过物镜照射样品，样品发出的荧光经同一物镜收集，透过二向色镜后由目镜或探测器记录，实现激发光与发射光的分离。

激发滤片（Excitation Filter）——选择特定激发波长；二向色镜（Dichroic Mirror）——反射激发光，透射荧光；阻断滤片（Barrier/Emission Filter）——阻挡残余激发光，只允许荧光通过。三者组合形成"荧光滤光块"，决定可观察的荧光颜色。

超高压汞灯需预热数分钟；关闭后须等待 ≥5分钟 才能再次启动；油镜观察须使用无荧光特殊油；未安装滤光片时禁止裸眼直视光源，防止紫外线伤眼。

CLSM的核心是"点照明、点探测"。激光束经物镜聚焦到样品焦平面的一个极小点，激发的荧光信号沿原路返回，经过一个关键部件——针孔（Pinhole）：焦平面上的荧光可以通过针孔到达探测器（PMT），而焦平面外（上下层）的散射光和荧光被针孔阻挡。振镜驱动激光束在X-Y方向逐点高速扫描（可达10万点/秒），计算机同步记录每点信号，重建一张高对比度二维图像。通过步进Z轴，可获得不同深度的光学切片，再由计算机三维重建出样品立体结构，无损伤地实现光学切片。

分辨率约为普通光学显微镜的3倍（水平 <200nm，垂直 <500nm）；消除焦外杂光，信噪比极高；支持多通道荧光同时成像；可实时追踪活细胞内离子浓度（Ca²⁺、pH等）；具备光漂白后恢复（FRAP）、激光显微外科等功能。

1932年由Ruska发明。以高压加速的电子束为光源（波长比可见光短10万倍以上），将电子束穿透超薄样品（<100nm），经静电和电磁透镜聚焦，投影到荧光屏或CCD相机上。电子与样品中不同密度区域的散射差异形成反差。分辨率可达0.2nm，放大倍率可超过5000万倍。样品须经固定、脱水、树脂包埋后超薄切片，表面用重金属染色以增加散射差异。

20世纪60年代问世，专门用于观察标本表面三维形貌。聚焦电子束在样品表面逐点扫描，激发出次级电子，次级电子数量与电子束入射角相关（即与表面微观起伏相关）；探测器收集信号经转换放大后在屏幕上同步显示立体图像。样品须固定脱水后喷涂重金属薄层（如金/铂），分辨率为6–10nm，有效放大倍率约20000×。ESEM（环境扫描电镜）可对潮湿样品成像。

由 Binnig 和 Rohrer 于1981年在IBM苏黎世实验室发明，并因此于1986年荣获诺贝尔物理学奖。STM基于量子力学的隧道效应：当原子尺度的导电针尖（理想为单原子尖端）在距样品表面不足1nm的高度扫描时，两者的电子云发生重叠。施加数mV至2V的偏置电压，电子无需物理接触即可在针尖与样品间隧穿，产生隧道电流。隧道电流对针尖-样品距离极为敏感（距离减少0.1nm，电流增加约一个数量级），因此可以实现横向0.1~0.2nm、纵向0.001nm的超高分辨率，可直接观察单原子排列。

恒流模式（Constant Current）——反馈回路维持电流恒定，通过Z轴压电陶瓷调节针尖高度跟踪表面形貌，适合粗糙表面，成像精度高；恒高模式（Constant Height）——固定Z位置扫描，电流变化直接反映形貌，扫描速度快，适合平坦表面和动态过程成像。

优势：固态、液态、气态样品均可观测，无需真空制样（区别于电镜）；可直接观察DNA、RNA、蛋白质分子的原子布阵；可在室温甚至溶液中工作。局限：仅适用于导电或半导体样品（绝缘材料需AFM）。